Al regresar a la isla durante su segundo viaje en 1493, Colón encontró que el Fuerte de La Navidad había sido atacado y destruido por indígenas a cargo del cacique Caonabo. Entonces decide construir La Isabela, la primera ciudad europea del Nuevo Mundo, y organizó varias expediciones al interior de la isla que resultaron en la construcción de algunas fortalezas y en el control del Cibao.

Antes de partir a España, Colón dejó a cargo de la colonia a su hermano Bartolomé Colón quien, como Adelantado de la isla, fundó la ciudad de Santo Domingo en 1496. Pero los desórdenes y las sublevaciones motivaron que la Corona Española enviara a Francisco de Bobadilla para hacerse cargo de la situación, quien ordenó como primera medida la detención de Cristóbal Colón y su familia, quienes fueron embarcados hacia la Península. Le sucedió Nicolás de Ovando y luego el hijo del almirante, Diego Colón, entre los años 1509 y 1523.

Durante la conquista y colonización, se estableció el primer Obispado (1504), la primera Capitanía General, el primer Virreinato y la primera Real Audiencia (1511) de toda América; se construyó la primera iglesia (Ermita del Rosario, 1496), el Hospital de San Nicolás (1503) y la primera catedral (1530), entre otras edificaciones.

Durante el siglo XVI La Española gozó de buena posición económica y social; las primeras expediciones conquistadoras partían desde la isla. Pero desde finales de ese siglo y luego de la conquista de los grandes territorios de América del Norte y América del Sur, la isla fue quedando relegada a un segundo plano, hundiéndose cada vez más en la pobreza y el olvido.